摘要
由于缺乏明确区分神经细胞类型的方法，对控制中枢神经系统发育和功能的细胞-细胞相互作用的理解长期以来一直受到限制。在这里，我们描述了前瞻性的分离和纯化星形胶质细胞，神经元和少突胶质细胞从发育和成熟的小鼠前脑。我们使用FACS(荧光激活细胞分选)从S100β启动子控制下表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的转基因小鼠中分离星形胶质细胞。然后，我们使用Affymetrix基因芯片阵列，通过对这三种主要的CNS神经细胞类型在出生后第1天(P1)到P30之间的不同年龄的基因图谱，创建了>2万个基因表达水平的转录组数据库。该数据库提供了急性分离星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞表达基因的详细全球特征和比较。我们发现Aldh1L1是一种高度特异性的星形胶质细胞抗原标记物，与传统星形胶质细胞标记物GFAP相比，其星形胶质细胞表达模式更为广泛。星形胶质细胞在特定的代谢和脂合成途径以及draper/Megf10和Mertk/integrin α中富集vβ5吞噬通路表明星形胶质细胞是专业的吞噬细胞。我们的发现对“胶质”细胞类的概念提出了质疑，因为星形胶质细胞和少突胶质细胞的基因谱彼此之间的差异就像它们与神经元之间的差异一样。这个急性分离纯化星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的转录组数据库，通过提供改进的细胞类型特异性标记物和更好地理解神经发育、功能和疾病，为神经科学界提供了资源。
介绍
在控制我们大脑的发育、功能和病理过程中，神经元-胶质细胞相互作用的性质和作用仍然是当今神经生物学中最大的未解之谜之一。特别是星形胶质细胞的发育和功能，这种细胞大约占老鼠脑细胞的三分之一，占人类脑细胞的近一半，基本上没有特征。在推进我们对成熟星形胶质细胞发育和功能的理解方面，一个主要的限制是缺乏对其进行前瞻性纯化的程序。星形胶质细胞的原代培养，只能从新生的啮齿动物的大脑中制备，已用于基因图谱和其他研究(McCarthy和De Vellis，1980年；Bachoo等人，2004年)．然而，这些星形胶质培养物显然来自一小群不断增殖的未鉴定胶质前体细胞，这些胶质前体细胞表达几种星形胶质细胞标志物，但似乎具有不成熟或反应性表型。因此，它们的特性与出生后和成人大脑中的成熟星形胶质细胞的关系尚不清楚。
全基因组转录图谱最近成为更好地理解已定义细胞类型的发展和功能的强大工具。例如，这些研究揭示了12种不同神经元亚型的详细分类树和细胞类型特异性基因表达模式(Sugino等，2006年)，描述了皮质投射神经元的特性和发育(Arlotta等人，2005年)和纹状体投射神经元亚型(Lobo等人，2006年)．此外，纯化的大鼠少突胶质细胞前祖细胞(OPCs)和髓鞘形成前期、有丝分裂后少突胶质细胞(OLs)最近已被分析，以揭示OL规范和分化过程中的发育基因表达变化(Dugas等人，2006年；尼尔森等人，2006年)．这些研究已经建立了小鼠神经元和大鼠OLs的基因表达谱，但由于缺乏净化出生后星形胶质细胞和髓鞘化OLs的方法，尚未可能对主要CNS神经细胞类型进行全面直接比较，这两种细胞都是非常脆弱的细胞类型。
在本研究中，我们报道了从出生后的小鼠前脑高度纯化星形胶质细胞、OLs和神经元的方法的发展。我们从出生后早期[出生后第1天(P1)]到出生后后期(P30)，对小鼠星形细胞进行了急性纯化，此时星形细胞分化在形态学上已经完成(Bushong et al.， 2004)，以及急性纯化的小鼠ol谱系细胞，从OPCs到新分化的OLs到髓鞘化的OLs。我们从每一种高度纯化、急性分离的细胞类型中提取RNA，并使用基因芯片阵列确定>2万个基因的表达水平，并构建一个小鼠前脑细胞类型特异性基因表达的全面数据库。对该数据库的分析证实了许多具有良好特征和功能的重要基因的细胞类型特异性表达。此外，我们还发现了数千个新的细胞富集基因，从而为星形胶质细胞、OL和神经元的相互作用、代谢、发育和功能提供了重要的新信息。该数据库提供了主要中枢神经系统细胞类型的全基因组转录谱的比较，是神经科学社区更好地了解中枢神经系统的发育、生理和病理的资源。
材料和方法
这些纯化步骤是基于前面描述的分离(西格尔等人，1998）和免疫甘蔗纯化方案（Barres等人。，1992年)．荧光激活细胞分选(FACS)和淘洗纯化程序的所有重要方面总结如下。额外的实验细节见补充材料(可在m.tanvirauto.com)．
流式细胞术纯化星形胶质细胞。
将分离的S100β-EGFP小鼠前脑重悬于摇瓶缓冲液中[含0.02% BSA和12.5 U/ml DNase的Dulbecco's PBS (DBPS)]，并依次置于以下摇瓶板上孵育:二抗板仅用于耗尽小胶质细胞，O4板用于耗尽OLs, PDGFRα板用于耗尽OPCs，第二O4板用于耗尽剩余的OLs。这个过程足以耗尽P8和更年轻的动物的所有ol谱系细胞，然而，在已经开始髓鞘化的老龄动物中，进一步耗尽OLs和髓鞘碎片的过程如下。离心收集最后一个O4培养皿中未粘附的细胞，将细胞重悬于含GalC、MOG和O1上清液的平底锅缓冲液中，室温孵育15分钟。将细胞悬液洗涤后重悬于含20 μg驴抗小鼠别藻蓝蛋白的摇瓶缓冲液中15 min。细胞在含碘化丙啶(PI)的摇瓶缓冲液中洗涤并重悬。EGFP+流式细胞术纯化星形胶质细胞。用高PI染色和前向光散射检测死亡细胞。通过对OL标志物GalC、MOG和O1的间接免疫染色，以高EGFP荧光和阴性APC荧光鉴定星形胶质细胞。细胞分选两次，经二次分选，常规获得纯度为99.5%的>。
FACS纯化神经元。
EGFP−细胞为去除小胶质细胞、OLs和星形胶质细胞后剩余的前脑细胞，主要由神经元组成，在较小程度上由内皮细胞组成(我们估计在P7时内皮细胞<4%，在P17时内皮细胞<20%)。EGFP−将S100β-EGFP分离的前脑细胞与星形细胞同时纯化，并根据EGFP阴性免疫荧光对细胞进行分类。细胞分选两次，常规得到>99.9%的纯度。在独立的准备，EGFP−通过依次标记生物素- bsl1凝集素和链霉亲和素- apc，同时如上所述标记OL标志物，内皮细胞和周细胞的细胞群也会减少。细胞分选两次，常规得到>99.9%的纯度。
少突胶质细胞谱系细胞的淘洗纯化。
分离的小鼠前脑在平移缓冲液中重悬。为了消耗小胶质细胞，将单细胞悬液依次在4个BSL1平板上平移。然后将细胞悬液依次置于两个PDGFRα板(净化和耗尽OPCs)、一个A2B5板(清空任何剩余OPCs)、两个MOG板(净化和耗尽髓鞘OLs)和一个GalC板(净化剩余的PDGFRα)上−, MOG−OLs)。第一块PDGFRα、MOG和GalC板上的贴壁细胞被洗涤，以去除所有抗原阴性的非贴壁细胞。然后用Qiagen RLT裂解缓冲液将细胞裂解，同时将细胞粘附在培养皿上，并纯化总RNA。纯化的OPCs >95% NG2阳性，0% MOG阳性。纯化的髓磷脂OLs为100% MOG阳性，>95% MBP阳性，0% NG2阳性。OPCs和髓磷脂OLs清除后的纯化GalC OLs的MOG阳性<10%，NG2弱阳性~ 50%，这反映了它们最近发展为早期OLs。
数据规范化和分析。
使用Affymetrix GCOS和Microarray Suite (MAS) 5.0算法对原始图像文件进行处理。每个芯片的强度数据归一化为500的目标值，并确定单个探针集的表达数据和缺席/在场调用。基因表达值也通过使用带有不变集归一化和PM模型的dChip软件包跨阵列进行归一化和建模计算(www.dchip.org） (李和王，2001年)．利用这些方法，我们报道了PCR验证率为>90% (Dugas等人，2006年)．29个样本分为9个样本类型:Astros P7- p8、Astros P17、Astros P17-灰质(P17g)、Neurons P7、Neurons P17、Neurons-内皮细胞耗尽(P7n、P17n)、OPCs、GalC-OLs和MOG-OLs。基因筛选以选择在至少一种细胞类型中一致表达的探针集，其中一致表达被定义为存在，并且在该细胞类型中至少三分之二的样本中MAS 5.0强度水平为>200。在45,037个探针组中，我们鉴定了20,932个探针组在9种细胞类型中的至少一种中一致表达。微阵列(SAM)方法的意义分析(Tusher等人，2001年)来确定在不同细胞类型之间显著差异表达的基因(SAM细胞类型分组见补充表S2，可在m.tanvirauto.com作为补充材料)。采用r中全连锁hclust方法进行聚类，在相应的SAM统计分析中计算这些样本的平均表达值，然后从表达强度中减去平均值，转化表达值进行聚类。保存日志2数据的尺度，除非另有说明，没有进行方差归一化。图是使用r中的gplot包创建的。Bioconductor软件包(绅士等，2004年)在表达式分析中一直使用。功能分析通过独创性路径分析(IPA)进行(Redwood City, CA)。
基因芯片数据已在NCBI基因表达综合(GEO;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，并可透过GEO系列登录号码登入GSE9566．
免疫组织化学。
用DPBS灌注小鼠或大鼠，再用4% PFA灌注，4°C后置4% PFA过夜。大脑在4°C的15%蔗糖中冷冻过夜，并冷冻在1份Tissue-Tek o.c.t和2份30%蔗糖中。切片在室温下用50%山羊血清和0.4% Triton X-100 PBS封闭45分钟。兔抗大鼠Aldh1L1血清(Krupenko和Oleinik, 2002年)在4°C的条件下添加两个晚上，使用1:1000。切片用Alexa Fluor 594或488山羊抗兔高杂交吸附二抗1:500室温孵育2小时。
结果
CNS细胞类型的纯化
为了纯化星形胶质细胞，我们利用了在S100β启动子控制下表达EGFP的转基因小鼠(左等，2004)，一种成熟的胶质细胞标记物(Ludwin等人，1976年)．我们选择了S100β-EGFP Kosmos系，该系在星形胶质细胞中表现出强烈的EGFP荧光。因为我们发现这种转基因系也在ol系细胞中表达EGFP，所以我们的纯化策略(图1一个)首先将EGFP阳性(EGFP+免疫筛选OLs和OPCs。这个过程足以耗尽所有OL谱系细胞从动物P8和年轻,然而,在旧的动物开始,髓磷脂的附加损耗OLs和髓磷脂是必要的用immunolabeling GalC残骸,MOG, O1和APC荧光二次抗体流式细胞仪中删除任何剩余的OLs排序。在耗尽ol系细胞后，我们用流式细胞术纯化EGFP+星形胶质细胞通过连续两次分选得到>99%纯度的星形胶质细胞(补充图S1，可在m.tanvirauto.com作为补充材料)。我们在早期发育阶段(星形胶质细胞刚产生且未成熟(P1-P8))和后期(星形胶质细胞发育接近完成且成熟(P17-P30))纯化了前脑星形胶质细胞(Bushong et al.， 2004)．在一些实验中，我们还从P17脑皮质灰质中特异性纯化星形胶质细胞，以纯化原质星形胶质细胞。基于这些实验，以及成熟纤维性星形胶质细胞的脆弱性，我们怀疑我们纯化的前脑星形胶质细胞对原浆星形胶质细胞高度富集。高纯度的星形胶质细胞通过检测CNS细胞类型的标记物得到证实:星形胶质细胞标记物仅由facs纯化的EGFP表达+星形胶质细胞和神经元、OL、小胶质细胞和内皮细胞标志物处于背景水平(图1一部）（补充表S1，可用m.tanvirauto.com作为补充材料)。
星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的纯化。一个、星形胶质细胞和神经元的纯化。小鼠前脑细胞悬液使用OL谱系特异性抗体进行免疫扫描，清除OPCs和OL。用流式细胞术纯化egfp阳性星形胶质细胞，从剩余细胞中分离星形胶质细胞。facs纯化的egfp阴性细胞被分离出来，代表一个丰富的神经元群体。B、OLs的纯化。细胞悬液的小鼠前脑第一次被耗尽的小胶质细胞通过平移BSL1凝集素平移盘子,剩下的细胞被孵化PDGFRα平移盘子净化和消耗信息公开化,MOG平移盘子净化和耗尽髓鞘OLs,和GalC淘砂盘净化剩下的OLs。一部，星形胶质细胞标记物表达水平(C)、OLs (D)和神经元(E）显示每种细胞类型的高纯度。的y-axis表示MAS 5.0测定的基因表达水平。误差柱代表±SEM。
从EGFP阴性(EGFP)人群中收集神经元−)小胶质细胞、OLs和星形胶质细胞耗尽后残留的细胞(图1一个)．这些EGFP−细胞主要由神经元和内皮细胞组成。在某些制剂中，内皮细胞从EGFP中被耗尽−用BSL1凝集素标记人口。由此得到的纯化的神经元群对星形胶质细胞，OLS，小胶质细胞和内皮细胞的标志物产生阴性（图1一部）（补充表S1，可用m.tanvirauto.com作为补充材料)。
纯化小鼠OPCs，OLS和髓鞘蛋白（髓鞘），我们使用免疫丹宁技术和阶段特异性抗体来纯化来自p16小鼠前脑的细胞（图1B)．我们的策略依赖于阶段特异性OL前体细胞标记血小板来源的生长因子受体α (PDGFRα)，它由OPCs (霍尔等人，1996年)、阶段特异性OL标志物髓鞘寡突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein, MOG)的表达体内局限于成熟的OLs，与这些细胞开始形成髓鞘的时间一致(索利等人，1996)．在从细胞悬浮液中纯化并耗尽OPCs和髓磷脂OLs后，我们使用泛ol单克隆抗体GalC纯化新分化的OLs，以产生一个新分化的OLs群体，该群体耗尽了OPCs和髓磷脂OLs。通过检测CNS细胞类型标记物，证实了OPCs、OLs和髓磷脂OLs的高纯度:OL标记物仅由免疫纯化的OPCs、OLs和髓磷脂OLs表达，而星形细胞、神经元、小胶质细胞和内皮细胞标记物处于背景水平(图1一部，补充表S1，载于m.tanvirauto.com作为补充材料)。
这些用于星形胶质细胞，神经元和OL的纯化方法依赖于已知的细胞型特异性标记物。为了确认我们的纯化细胞代表小鼠前脑中的主要细胞类型，我们从整个未加工的前脑中纯化mRNA。然后，我们检查了整个前脑表达的基因，以证实它们可以通过我们的星形胶质细胞，神经元和OLS的纯化群体，以及微胶质细胞和内皮细胞的粗产物。我们发现，基本上，整个前脑表达的所有基因由这些细胞群中的至少一种表明，这表明我们的纯化细胞群在一起构成小鼠前脑中的主要细胞类别。
所有样品年龄和纯化方法的完整描述见补充表S2和补充实验程序(可在m.tanvirauto.com作为补充材料)。
CNS细胞类型的基因表达谱分析
从纯化的细胞类型制备的总RNA，使用两步线性扩增协议与poly(a)引物，扩增mRNA的3 '端，生成标记的cRNA。该标记的cRNA与Affymetrix Mouse 430 2.0阵列杂交，该阵列包含与mRNA转录本的3 '端互补的寡核苷酸探针集(3 '阵列);每个阵列包含45,037个寡核苷酸探针，代表20,832个独特的基因。此外，利用随机引物一步线性扩增技术生成标记的cDNA，扩增所有RNA。该标记的cDNA与Affymetrix小鼠外显子1.0 ST阵列杂交，与整个mRNA分子(外显子阵列)的区域互补的寡核苷酸探针集，代表17213个基因，定义了转录水平探针选择和表达指标(邢等，2006)．我们使用3 ' -阵列生成的数据进行主要分析，使用MAS 5.0算法生成表达值和缺席/出席(A/P)调用，并使用dChip、SAM和Bioconductor软件进行统计分析和聚类。
对代表相同纯化细胞类型和发育阶段的生物复制样本进行分组，然后我们创建了一个至少在一个细胞群体中一致表达的探针集的主列表(见材料和方法)。这20932个探针组代表了12416个在至少一种CNS细胞类型中显著表达的独特基因。所有20932表示的探测集的表达式值的主数据表出现在补充表S3中(可在m.tanvirauto.com作为补充材料)。我们的统计分析和聚类继续这一筛选的表达基因列表。
对纯化细胞类型样本的无监督层次聚类显示，星形胶质细胞、神经元和OLs各有不同的基因表达模式。的系统树图图2有三个主要分支，分别代表星形胶质细胞、神经元和OLs。在每个细胞类型中，样本根据它们的发育阶段聚集在一起。聚类结果表明，生物重复之间具有较高的重现性，同一细胞类型之间具有很强的相似性。细胞类型的相似性与星形胶质细胞、神经元和OLs之间的巨大差异形成对比。有趣的是，星形胶质细胞和OLs的成对比较之间的相关性并不比这两种细胞类型与神经元的成对比较强。考虑到每一种成熟中枢神经系统细胞类型的高度专门化功能，它们的基因表达谱高度分化，并且每一种都代表着同样独特的细胞类型，这并不令人意外。
纯化CNS细胞类型的树状图和样本聚类。来自不同发育阶段的高度纯化的CNS细胞类型样本的分级聚类显示了三种不同的簇，分别代表星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞。不同样本之间基因表达的相似性用树状图上每个分支的垂直距离来表示。生物复制在样本内显示出最高程度的相关性，以较短的垂直距离表示。在每个细胞群体中，成熟和成熟样本(Astros P7, Astros P17, OLs, Myelin OLs)之间的基因表达相关性高于未成熟和成熟样本(Astros P1, Astros P7, OPCs, OLs)之间的基因表达相关性。颜色条和样品标签描述每个样品类型(绿色，星形胶质细胞;黄色,神经元;橙红色，OL系细胞;P，出生后日，用不同色度表示;G，大脑皮层灰质星形胶质细胞; n, neuron samples depleted of residual endothelial cells).
通过对所有12416个表达基因的无监督层次基因聚类生成的热图显示了基因水平上的细胞型基因表达模式(补充图S2，可在m.tanvirauto.com作为补充材料)。几乎所有基因都显示星形胶质细胞、神经元和OLs之间的细胞类型聚类，许多基因还根据细胞的发育阶段聚类。这些基因簇似乎平均分布在所有细胞类型中，这加强了我们的发现，即星形胶质细胞和OLs并不比神经元更相似。长期以来，星形胶质细胞和OLs一直被归为“胶质细胞”一类，以表明它们可能具有共同的特征和功能。尽管我们的数据没有解决星形胶质细胞和OLs的共同谱系问题，但这些数据表明，成熟星形胶质细胞和OLs并不共享一大群共同的“胶质”基因，并指出，分子定义的胶质细胞类型的概念很大程度上是误导，因为这三种成熟细胞类型的差异很大程度上取决于它们表达的基因。
神经细胞类型特异性基因的鉴定和验证
定量比较星形胶质细胞、神经元和OL基因表达，可以识别出在每种细胞类型中差异过表达的所有基因。通过微阵列(SAM)显著性分析，所有基因富集至少1.5倍，且具有统计学差异，错误发现率(FDR)阈值<1% (Tusher等人，2001年)载于附表S4-S6(可于m.tanvirauto.com作为补充材料)。这些基因包括2618个星形细胞富集基因、2036个神经元富集基因和2228个ol富集基因。根据以前建立良好的细胞类型标记物的富集水平(补充表S1，可在m.tanvirauto.com作为补充材料)，>富集20倍的基因被认为是细胞类型特异性基因。星形胶质细胞、神经元和OL细胞类型特异性基因排名前40位图3前250个基因出现在补充图S3(可在m.tanvirauto.com作为补充材料)。正如预期的那样，前40个细胞类型特异性基因包括了完善的细胞类型特异性标记，验证了我们的分离程序。然而，这些基因中有许多以前没有被描述为中枢神经系统中特定的细胞类型，它们的功能作用还不清楚。
星形胶质细胞，少焦细胞和神经元特异性基因的表达。描绘了由星形胶质细胞（绿棒），神经元（黄棒）和少突胶质细胞（红杆）表示的40个细胞类型特异性基因。每个单独的基因表达水平归一化（参见材料和方法）并绘制在日志上2颜色比例，蓝色代表低表情，红色代表高表情。从测井曲线可以估计褶皱的富集程度2例如，从中蓝色(−2)到红色(3)的色块比例代表了32倍的表达水平差异。
我们将基于3 '阵列数据的前40个细胞类型特异性基因列表与我们的外显子阵列数据进行了比较，以确认这些基因的细胞类型特异性。我们首先利用Affymetrix提供的映射文件和我们在netafffx上的人工查询，从3 '阵列探针集(总共120个探针集)中，将排名前40的星形胶质细胞、神经元和ol特异性基因映射到小鼠外显子阵列转录簇中。在120个3 '阵列探针集中，101个被明确地定位到由核心探针集代表的唯一外显子阵列基因标识符。根据外显子阵列表达指标，在这101个基因中，92个(91%)在各自的细胞类型中至少富集了15倍，100个(99%)至少富集了5倍，最小的外显子阵列倍数变化为3.9(补充表S7，可在m.tanvirauto.com作为补充材料)。除了验证3 '阵列的结果，外显子阵列转录水平数据算法被优化，以提供独立于不同mRNA剪接形式的总体基因表达水平(邢等，2006)．因此，当一个基因被外显子阵列数据确认时，就表明该基因是细胞类型特异性的，而不管基因剪接如何。17213个不受剪接影响的基因的外显子阵列表达值的完整列表见补充表S8(可在m.tanvirauto.com作为补充材料)。使用外显子阵列数据来识别细胞类型特异性基因剪接的额外分析正在进行中。外显子阵列的结果使用了不同的标记方法和探针选择区域，为从3 ' -阵列中发现的CNS细胞类型特异性基因提供了强有力的独立证据。
我们下一个执行原位杂交(ISH)，以确认CNS中一些新的细胞类型特异性基因(图4)．在神经元中高度富集的几个任意选择的基因的ISH (图4A-F.Nov、Tmem130和Brunol4)证实，在所有三例中，这些基因的表达模式与神经元特异性表达一致，尽管神经元亚型之间的分布在基因之间存在差异，其中Nov表现出比Tmem130或Brunol4更受限的皮质表达。类似地，在星形胶质细胞中高度富集的基因的ISH (图4胃肠道(Ntsr2, Aldh1L1和Acsbg1)的表达模式与星形细胞特异性表达一致，染色显示标记了广泛分布于大脑皮层的许多小细胞体和小突起。在OLs中高度富集的基因(图4J-L， Fah2, Tmem125/6330530A05Rik和Gpr62)的染色模式与ol特异性表达一致，染色主要局限于白质和皮质内的散在细胞。对于给出上述背景ISH的细胞类型特异性基因，我们的分析表明，使用阵列数据预测的细胞类型特异性与使用ISH所看到的区域分布之间具有良好的一致性。
基因表达数据的验证原位杂交过程。A-C.，冠状脑切片表明由阵列数据鉴定的基因具有特定神经元表达：一个11月;BTmem130;C, Brunol4。D-L，对应于中轮廓区域的高倍放大图像一个显示海马，胼胝体(cc)和覆盖皮层。D-F，经阵列数据识别的具有特定神经元表达的基因，在海马和皮层中显示表达:D11月;ETmem130;F, Brunol4。胃肠道，基因阵列数据识别为星形细胞丰富的表达，显示纤维状，阳性细胞遍布白质和灰质:GNtsr2;HAldh1L1;我, Acsbg1。J-L， ISH为经阵列数据鉴定为具有特异性OL表达的基因，显示胼胝体白质表达，并在其上皮层偶有阳性细胞:JFa2h;KTmem125/6330530A05Rik;l，GPR62。所有ISH在P17鼠标大脑上进行。规模的酒吧:A-C.2毫米;D-L200μm。
因为我们的数据库列表更多cell-type-enriched基因比伊什自己,我们可以检查我们接下来相比我们的发现与艾伦大脑图集(ABA)项目,这是一个全面的伊什数据库识别解剖∼20000个基因表达模式的成年老鼠的大脑。ABA信息学过滤器识别具有相似空间分布模式的基因。用ISH模式训练这些过滤器，以建立细胞类型特异性标记物，用于预测新的细胞类型富集基因(Lein等人，2007年)．我们比较了44个星形胶质细胞富集基因、78个ol富集基因和69个神经元富集基因的ABA列表，以及我们对每个细胞类型mRNA水平的定量3 '阵列测定。ABA鉴定的每个基因星形胶质细胞、OL和神经元基因表达值的热图见补充图S4-S6(可在m.tanvirauto.com作为补充材料)。在我们的3 ' -array分析中，191个ABA细胞类型特异性基因中有178个(93%)在纯化的CNS细胞中表达。在这些表达基因中，有141个(79%)>细胞型富集1.5倍，106个(60%)>细胞型富集4倍，30个(17%)>细胞型富集20倍(细胞型特异性)。这表明ABA过滤器和我们的数据分析之间总体上是一致的，尽管我们的分析表明23个(13%)由ABA识别的基因实际上在另一种细胞类型中富集。
我们的两个数据集之间的比较显示了高度的一致性，也表明ABA是一种资源，补充了我们的每一种主要CNS细胞类型的全基因组基因表达值数据库。这也显示了定量的全基因组基因表达分析的力量。尽管ABA能够在其选择的近80%的基因中识别出正确的富含细胞类型的基因表达模式，但这些基因中很少有代表大多数细胞类型特异性基因。此外，我们的数据库还识别了更多的细胞型富集基因，包括不同细胞类型和不同发育阶段的定量基因富集水平。
Aldh1L1是一种新的星形细胞特异性标志物
描述新astrocyte-specific标记,我们检查了我们的基因表达数据库来识别astrocyte-specific基因的信使rna表达水平最高,最大的伊什标签模式在整个大脑,和蛋白质将表示在整个细胞(即,不局限于细胞立地)。其中一个符合这些标准的基因是醛脱氢酶1家族成员L1 (Aldh1L1)基因，也被称为10-甲酰基四氢叶酸脱氢酶(FDH) (Cook等人，1991年；安东尼和海因茨，2007年)．该基因的ISH表明其mRNA在整个CNS中以与泛星形细胞表达一致的模式表达(图4H)，已有研究表明Aldh1L1蛋白在成年大鼠星形胶质细胞中表达(Neymeyer等人，1997年)．用aldh1l1特异性多克隆抗体免疫组化染色显示高度分枝的星形细胞形态，包括星形细胞的细胞体及其广泛的突起。相反，GFAP抗体主要标记一些星形胶质细胞的厚的主要突起(图5A-C.)．所有GFAP阳性的细胞也都被Aldh1L1标记，而Aldh1L1强烈地标记了更多的星形胶质细胞。此外，Aldh1L1 mRNA在整个大脑中更广泛地表达，而GFAP在白质中更主要地表达(见Allen脑图谱)(补充图S7，可在m.tanvirauto.com作为补充材料)。Aldh1L1与神经元(微管蛋白)、OLs (CC1和MBP)和OPCs (NG2)的双重标记表明Aldh1L1不能标记其他类型的脑细胞(图5D-F)．Together, these findings identify Aldh1L1 as a highly, broadly, and specifically expressed astrocyte gene and indicate that it is a useful astrocyte-specific marker.
Aldh1L1是一种特异性的泛星形细胞标志物。A-F.，P15大鼠皮质的免疫组织化学染色显示ALDH1L1是细胞型特异性泛星形胶质细胞标记物。A-C.，对大鼠皮质进行Aldh1L1(红色)和GFAP(绿色)染色。一个， Aldh1L1同时标记了皮质中星形胶质细胞的细胞体和广泛的突起。BGFAP标记的是星形胶质细胞的中间丝细胞骨架，而不是Aldh1L1能够标记的更精细的过程。C， GFAP标记星形胶质细胞的一个亚群:有GFAP标记的细胞也是Aldh1L1阳性的(白色箭头)，而Aldh1L1标记的许多星形胶质细胞没有GFAP标记(黑色箭头)。D-F， Aldh1L1不标记神经元(D， Tuj1)， OLs (E， MBP + CC1)，或opc (F喜欢的《忍者外传2》)。胃肠道，合并（我)的Aldh1L1免疫染色(G)和强BAC Aldh1L1-EGFP荧光(H)，表明所有表达EGFP转基因的细胞同时也表达内源性Aldh1L1蛋白。规模的酒吧:A-F.40μm;胃肠道, 60μm。
一个BAC Aldh1L1-EGFP小鼠已经由GENSAT项目产生(Heintz 2004)．Aldh1L1在该小鼠中枢神经系统的弥漫表达模式与泛星形细胞表达一致(补充图S7，可在m.tanvirauto.com作为补充材料)。为了进一步验证Aldh1L1的表达模式，并确定该小鼠是否如实报告了EGFP在星形胶质细胞中的特异性表达，我们分析了该小鼠的脑冷冻切片。所示图5胃肠道，我们发现整个脑Aldh1L1免疫组化染色与EGFP共定位，证实BAC-Aldh1L1-EGFP转基因驱动EGFP表达的星形细胞特异性模式与内源性Aldh1L1蛋白相同。此外，EGFP扩散到细胞核内，使得在这些小鼠中识别星形胶质细胞变得特别容易。然后我们制备Aldh1L1-EGFP小鼠的细胞悬液，用对OLs的O4单克隆抗体进行免疫染色，并进行流式细胞仪分析，以确定Aldh1L1-EGFP小鼠是否可以用于流式细胞仪纯化星形胶质细胞。补充图S8(可在m.tanvirauto.com作为补充材料)显示egfp阳性星形胶质细胞和其余egfp阴性细胞之间的良好分离。此外，o4阳性的OLs是EGFP阴性的，表明Aldh1L1-EGFP小鼠比S100β小鼠更适合用于FACS纯化星形胶质细胞。这些数据表明Aldh1L1蛋白在星形胶质细胞中特异性表达，而不是在OLs或神经元中表达，因此Aldh1L1是比GFAP更好的星形胶质细胞免疫组化标记物，因为它能更好地标记星形胶质细胞的胞体和整个灰质和白质的加工过程。
我们已鉴定的最特定的神经细胞类型标记物已提供给神经单抗项目(http://www.neuromab.org)、nds GENSAT项目和NIH神经小鼠Cre项目，因此，低成本、高质量的抗体和小鼠品系应该很快就能在神经科学领域获得。
富含CNS细胞类型富含规范途径的分析
每种神经细胞类型优先表达的大量基因表明星形胶质细胞、神经元和OLs在许多基本信号和代谢途径中可能存在差异。为了更系统地确定在每种CNS细胞类型中富集的典型信号和代谢途径，我们使用了ingenious Systems公司的IPA工具。给定一个基因列表，IPA对这些基因在其手工策划的规范途径数据库中的富集进行统计测试。每个单独的IPA信号通路包括细胞外信号成分、细胞膜受体、下游效应子和转录因子，这些因子已经被描述与已发表的科学文献相互作用，每个通路通常包括30到100个或更多的个体基因。IPA代谢途径来源于KEGG代谢途径(Kanehisa等人，2006年)．这些工具使我们能够确定在每个特定细胞类型中显著富集的基因中所代表的顶级典型信号和代谢途径(补充表S4-S6，可在m.tanvirauto.com作为补充材料)。表1列出信令路径（A-C.)和代谢途径(D-F)在每个细胞类型中富集p<0.05。这些富集的信号通路可能受细胞 - 细胞相互作用的影响，受疾病过程的扰动，并受药物影响的生理效果。我们观察到12种显着富集的星形胶质细胞的代谢途径，但仅在OLS和神经元中只有三种，表明在CNS中能量代谢物和氨基酸产生的星形胶质细胞的显着作用（参见讨论）。
星形胶质细胞表达基因分析
通过分析急性分离的、高度纯化的星形胶质细胞，我们对其mRNA表达的全基因组分析提供了第一次真正全面的观察星形胶质细胞在发育和成熟的小鼠CNS中表达的基因，为星形胶质细胞的规格、发育、功能提供了新的见解，以及与血管和突触的信号相互作用。我们的分析鉴定出许多转录因子、信号转导跨膜受体和分泌蛋白在星形胶质细胞特异性和高表达(补充表S9-S13，可在m.tanvirauto.com作为补充材料)。星形胶质细胞的发育不如神经元和OLs那么容易理解。我们鉴定出星形胶质细胞中高度富集的DNA结合蛋白，有些蛋白含量非常高(补充表S10，可在m.tanvirauto.com作为补充材料)。这些基因包括转录激活因子和抑制因子，并且可能包含许多指定星形胶质细胞基因表达的关键基因。由于目前在哺乳动物的大脑中还没有已知的星形细胞特异性转录因子[尽管有一个在受限的脊髓域中被描述(武山等人，2005年)，这些星形细胞富集的基因代表了第一批星形细胞特异性转录因子。尽管只有三个基因(Rfx4、Pbxip1和Gli3)符合我们的星形细胞特异性标准(星形细胞富集至少20倍)，但许多基因都是星形细胞富集的。许多其他转录因子，如Sox2, Pax6, Id1和Id3，被认为在祖细胞中富集(Ramalho-Santos等人，2002年），以星形胶质细胞令人惊讶的高水平表达。这些发现提高了大多数成人星形胶质细胞是终端区别的持续存在的问题，或者在适当的情况下，能够分裂甚至恢复为茎细胞样行为（Doetsch等人。，1999年)．
许多受体已经被报道对早期星形胶质细胞发育很重要，如Bmpr1a、Bmpr1b、Bmpr2、Notch1/2/3和Fgfr3 (Song和Ghosh, 2004年)在我们的发育和成熟星形胶质细胞的资料中高表达和富集(补充表S11，可在m.tanvirauto.com作为补充材料)。Sonic Hedgehog受体修饰(Ptch1)和Shh信号传感器平滑(Smo)都在星形胶质细胞及其下游转录介质Gli2和Gli3中富集(鲁伊兹·阿尔塔巴等人，2002年；Palma et al.， 2005)．卷曲同源物2 (Frizzled homolog 2, Fzd2)是一种Wnt受体，高表达，是星形胶质细胞特异性基因之一。这些受体特征的信号通路，如TGF-β (BMP)、Notch、Sonic Hedgehog和Wnt/β-catenin信号通路，均被IPA (表1一个)．有趣的是，虽然下游Notch靶基因在OPCs成熟成髓鞘化OLs时关闭，但Notch靶基因仍然很高，有时在星形胶质细胞成熟时增加。虽然Notch信号在诱导神经祖细胞发育为星形胶质细胞(谷垣祯一等，2001)，这些发现表明Notch信号在维持星形胶质细胞命运中的作用更为持久。
我们在星形胶质细胞中发现了几个高度保守、完整的吞噬和吞噬分子通路(表2)．一个是细胞死亡异常（CED）途径首先鉴定为具有缺陷的细胞吞噬作用缺陷秀丽隐杆线虫也显示了轴突修剪的功能果蝇（周等，2004；Awasaki等人，2006)．ced基因形成两条平行的途径导致ced-10 (Rac1)激活和吞噬。第一个途径包含基因ced-1 (Megf10，果蝇ced-7 (Abca1)和ced-6 (Gulp1)均在星形胶质细胞中富集(表2)．ced-1的另一同源物是Lrp1 (cd91)，它也在星形胶质细胞中高表达和富集，是ApoE的受体，ApoE与家族性阿尔茨海默病(Corder等人，1993年)．第二个平行的ced途径是ced-2 (Crk)、ced-5 (Dock1)、ced-12 (Elmo)复合物，所有这些基因在星形胶质细胞中也都有高水平的表达，尽管不如ced-7/ced-6/ced-1途径(表2)．其他明确的吞噬通路的分子组成，受体酪氨酸激酶(Mertk和Axl)和αvβ5整合素通路(Finnemann和Nandrot, 2006年)，也被发现由星形胶质细胞表达。这些都是识别受体(见讨论)，参与吞噬被特定的调理素包裹的碎片。我们还鉴定了它们的同源配体，包括Mfge8和Gas6，在星形胶质细胞中富集。Mfge8是少数高表达的星形细胞基因之一，编码一种分泌蛋白，ApoE也是，两者的功能，至少部分，作为调理蛋白。总之，这些发现强烈表明星形胶质细胞在吞噬作用中发育和成熟的重要作用。
少突胶质细胞表达基因分析
OLs特异性基因列表表明，与星形胶质细胞和神经元富集基因列表不同，OLs中许多细胞类型特异性基因之前已经被描述过。鉴定了50个细胞类型特异性基因(>富集20倍)。在这些基因中，有16个是以前已经确定的OL基因，如髓鞘相关的少突胶质细胞碱性蛋白(Mobp)、转铁蛋白(Trf)和Claudin 11 (Cldn11)。在这50个ol特异性基因中，超过一半与DAVID数据库中的“膜”相关(http://david.abcc.ncifcrf.gov/考虑到OLs在髓鞘膜形成中的高度专门化功能，这或许并不令人惊讶。这些包括先前描述的OL家族标记物，如MOG、髓磷脂和淋巴细胞蛋白(Mal)，脂质代谢和合成所需的酶，如半乳糖-3-o-磺基转移酶1 (Gal3st1)和UDP半乳糖基转移酶8a (Ugt8a)，以及功能未知的新跨膜蛋白，如跨膜蛋白10 (Tmem10/opalin)、Tmem125/6330530A05Rik和生态病毒整合位点2a (Evi2a)(补充表S5，可在m.tanvirauto.com作为补充材料)。基因模型98是一种可能的转录因子(B. Emery和B. a . Barres，未发表的观察结果)，被认为是由OLs最广泛和特异表达的基因之一，这被ABA中的ISH所证实。令人惊讶的是，APP、APLP1、APLP2及其加工相关基因(Tace除外)在OLs中高表达，而且几乎所有基因在OLs中都比在神经元中高表达。例如，β位点app - cleaved酶2 (Bace2)在OLs中富集了12倍，并随着OLs的分化而强烈上调(图6.．我们观察到，随着OLs成熟，整个Wnt平面极性通路高度激活，表明该通路在Ranvier和副结组织中发挥重要作用。我们还鉴定了许多富含OL的跨膜受体、转录因子和分泌蛋白，它们在OL生物学中的具体作用尚不清楚。代谢差异包括肌酸(Gamt和Gatm)和肉碱合成酶的优先表达(补充表S14，可在m.tanvirauto.com在OLS中作为补充材料）。
星形胶质细胞和少突胶质细胞发育过程中基因的上调和下调。星形胶质细胞发育过程中下调幅度最大的60个基因(一个，浅绿色吧）和开发（B在星形胶质细胞发育过程中上调最多的前60个基因(C，深绿色条)和OL开发(D、红酒吧)。这些基因被绘制在一张热图上，以说明所有CNS细胞类型在不同发育阶段的基因表达模式。每个细胞类型的个体基因表达水平归一化为年龄平均星形细胞表达(一个，C）和年龄平均（B，D)．归一化后的值绘制在对数上2颜色比例，蓝色代表低表情，红色代表高表情。从测井曲线可以估计褶皱的富集程度2颜色条的规模。例如，从浅蓝色(−1)到中红色(2)的变化代表了表达水平的8倍差异。注意，尽管少数基因在发育过程中强烈下调(一个，B)以细胞类型特异性模式表达，大多数基因在发育过程中强烈上调(C，D)以细胞类型特定的模式表示。
神经元表达的基因分析
由于区域和亚型神经元异质性的巨大程度，泛神经元标记物的鉴定长期以来一直存在问题。我们的研究结果，结合ABA上的ISH模式，表明广泛使用的神经元标记如Map2, Tau, HuC/Elav3, Gap43, Prpc和电压依赖性钠通道并不是由神经元特异性表达的，而许多特定的神经元基因如Eno3/NSE, Camk2，和神经丝链L, M，和H仅由神经元子集表示。正如我们的研究结果所证实的，许多突触囊泡蛋白(如synaptotagmin I (Syt1))在神经元中是特异性和广泛表达的，但由于它们的突触积累，在冷冻切片中对神经元细胞体的鉴定并不有用。在我们的基因谱中，我们发现表达频率最高、最明确、最广泛的神经元基因是stathmin-like-2(见ABA)，也被称为Scg10。我们还鉴定了Bruno家族的RNA结合蛋白Brunol4、Brunol5和Brunol6 (Good等人，2000年)，高度神经元富集(尽管它们绝不是泛神经元)。该基因家族与发育调节的选择性剪接有关(Ladd等人，2001年)，而Brunol6先前已被ISH证明是神经元特异性的(McKee等，2005年)．布鲁诺家族的三个成员的神经元富集表明这些基因是神经元特异性基因剪接的重要因素。最后，我们鉴定了几个高表达的神经元分泌蛋白，包括neuregulin 3和Nov/Ccn3。后者是结缔组织生长因子家族的成员，在大脑皮层(图4一个)．Nov是一种富含半胱氨酸的分泌蛋白，被认为是一种生长因子(Liu et al.， 1999Nov的一个受体是Ddr1 (Das等人。，2006年)，我们的数据表明，星形胶质细胞和OLs在发育中(而非成熟)高度表达。
星形胶质细胞和少突胶质细胞发育过程中的基因表达变化
接下来，我们通过比较发育中的(P7-P8)和成熟的(P17)星形胶质细胞，以及OPCs和髓化OLs (MOG)，确定了星形胶质细胞和OL发育过程中显著上调和下调的基因(>为1.5倍，FDR <1%)+(补充表S15-S18，可在m.tanvirauto.com作为补充材料)。星形胶质细胞和OL发育过程中上调和下调最多的60个基因显示在图6前250名的数据见补充图S9(可在m.tanvirauto.com作为补充材料)。P17和P30星形胶质细胞的整体基因表达非常相似，在星形胶质细胞发育过程中上调的基因在P17到P30期间并没有继续改变(补充Figs)。S2和S9, P30星形胶质细胞柱，可在m.tanvirauto.com作为补充材料)。这表明星形胶质细胞大约在出生后14-21天获得成熟形态(Bushong et al.， 2004)，通过P17，它们也表达成熟的基因表达谱，星形胶质细胞发育基本完成。
我们发现几乎所有的基因在星形胶质细胞和OL发育过程中强烈下调(图6.A、B)在中枢神经系统中由另一种细胞类型表达，60人中只有11人(18%)富集星形细胞，60人中只有3人(5%)富集OL细胞。这表明，下调最多的基因代表增殖和中枢神经系统发育所需的基因，而不是涉及特定细胞类型发育过程的基因。相比之下，在星形胶质细胞发育过程中上调最强烈的基因中，60个基因中有46个(77%)富含星形胶质细胞，几乎所有OL发育过程中上调的基因中有58个(97%)富含OL。
星形胶质细胞发育过程中下调幅度最大的基因中，有超过一半的基因在OL发育过程中也下调了，其中许多基因参与了细胞周期，如丝裂原信号通路、细胞分裂周期调节蛋白、着丝粒蛋白、基因组复制蛋白等。在星形胶质细胞和OPCs中，一个典型的下调基因是母体胚胎亮氨酸拉链激酶(Melk)，它是一种自我更新的神经祖细胞的标记，在增殖祖细胞中促进细胞周期(中野等人，2005年)．Melk从P7下调10倍至P17，在所有P17星形胶质细胞和髓磷脂OL样本中均缺失。仔细观察星形胶质细胞中的基因表达下调50强显示了类似的模式,与48 50(96%)低于阈值的表达式P17脑灰质皮层星形胶质细胞,强烈建议完全衰老细胞分裂在绝大多数由P17皮质星形胶质细胞,曾被记录下来。nestin是OPCs不表达的特征明确的星形胶质细胞前体细胞标记物的一个例子，该标记物在发育过程和损伤后由放射状胶质细胞和星形胶质细胞表达，但正常成熟星形胶质细胞不表达。Nestin在P1 - P7星形胶质细胞中下调3倍，在P7 - P17星形胶质细胞中下调4倍，在所有P17星形胶质细胞中均为缺失。在星形胶质细胞发育过程中下调最多的两个基因是未鉴定的DNA结合蛋白(Tcfcp2l1和Riken基因2310005P05具有螺旋-发夹-螺旋DNA结合，1类蛋白结构域)。它们都富含星形胶质细胞(分别为13倍和5倍)，且不由OPCs表达，表明在星形胶质细胞谱系发展中具有特定的作用。
在星形胶质细胞发育过程中上调最强烈的基因之一是BC055107，这是人类的同源物，称为dr1 /Tu3a/Fam107a。在CNS神经细胞类型中，Drr1是星形胶质细胞特异性的(星形胶质细胞的富集倍数为21倍)，是表达水平最高的基因之一。Drr1是一个具有核定位信号的144氨基酸蛋白，被鉴定为在多种组织的肿瘤中缺失的人肿瘤抑制基因(Wang et al.， 2000)．dr1在小鼠星形胶质细胞发育过程中的强烈上调，结合其作为肿瘤抑制因子的特性，强烈表明dr1在维持细胞处于静止、不增殖状态中的功能作用。该基因在未来的研究中值得关注，以确定是否多态或突变倾向于胶质母细胞瘤的易感性。
在OPC分化期间下调基因的发现通常由其他CNS细胞类型表达（图6.B)表明相对于分化的OLs的标记，opc特异性标记的缺乏。这一趋势的例外包括两个已建立良好的OPC标记，PDGFRα和NG2/Cspg4，以及一些特征不太明确的基因，如Matn4、Ligand-of-Numb protein X (Lnx1)、蛋白激酶cmp依赖(Prkg2)和锌指BED domain containing 4 (Zbed4)。Zbed4是人类hAT家族的一员，自结合并作为细胞周期基因的转录激活因子(Yamashita等人，2007年)．g蛋白偶联受体17 (Gpr17)在发育中的OLs中强烈而特异地表达，并在成年时对成年OPCs表现出特异性。
由于OPCs分化为OLs，然后是髓磷脂OLs(补充表S18, S19，可在m.tanvirauto.com在髓磷脂基因上调的同时，它们的基因谱显示了可能维持细胞骨架的细胞骨架和基质基因的显著下调。以及大量基因的强烈上调，这些基因的功能似乎是解聚细胞骨架(如gelsolin)或瓦解细胞骨架(如ephrin和信号通路中的蛋白质)，所有这些都可能是髓磷脂压实所必需的。与MOG和体内髓鞘化包括与paranode相关的基因，以及Ranvier正常结形成所需的基因，如MAL、透明质酸和蛋白多糖连接蛋白2 (Hapln2)、Contactin 3 (Cntn3)、Cntn2、Nkx6.2、Stathmin1 (Stmn1)和RIKA330104H05 (Ermin)。这些观察结果强烈表明，髓鞘形成背后的基因可能以不同的波被调节(Dugas等人，2006年)，第一种参与神经纤维的鞘膜，第二种参与建立细胞间连接，参与Ranvier结的形成和维持。
的比较体内星形胶质细胞与在体外培养的星形洛杉矶
星形胶质原代培养物(McCarthy和De Vellis，1980年)长期以来一直担任在体外代理为研究体内星形胶质细胞，然而，培养的星形胶质细胞的制备与正常功能的星形胶质细胞之间的关系尚不清楚。的无监督层次聚类在体外培养的星形胶质蛋白样本以及体内纯化的脑细胞类型显示，培养的星形胶质细胞与星形胶质细胞聚集在一起，但它们的分支水平与OPC远离OLs的分支水平相似(补充图S10，可在m.tanvirauto.com作为补充材料)。基于它们的基因表达谱，这些数据表明培养的星形胶质细胞和体内星形胶质细胞之间的差异就像OPCs和OLs之间的差异一样。热图见补充图S11(可在m.tanvirauto.com作为补充材料)显示了所有12,416个CNS表达基因的全球基因比较，表明培养的星形胶质细胞表达许多星形胶质细胞表达的基因，而一般不表达那些在神经元或OLs中富集的基因。虽然表达相似，但可以清楚地看到，部分星形胶质细胞基因在培养星形胶质细胞中不表达，而部分星形胶质细胞表达的基因在培养星形胶质细胞中不表达体内．这是相对的在体外其他CNS细胞类型如OPCs、OLs和视网膜神经节细胞的培养，其中培养细胞表达的基因与表达的基因密切匹配体内（Dugas等人，2006年；Wang et al.， 2007)．这不能用星形胶质细胞培养基中血清的存在来解释，因为当我们将星形胶质细胞培养在无血清的培养基中时，这些差异仍然存在(数据未显示)。比较培养的星形胶质细胞和体内并鉴定出2103个培养的富星形胶质基因和2819个体内星形细胞富集基因(补充表S20, S21，可在m.tanvirauto.com作为补充材料)。
这些结果清楚地表明，培养的星形胶质细胞并不代表相同的细胞类型体内星形胶质细胞是一种类似星形胶质细胞的细胞类型。一种假设是，培养的星形胶质细胞代表星形胶质细胞谱系的一个不成熟阶段，如胶质前体细胞;另一种假设是培养的星形胶质细胞反映了反应性星形细胞表型。为了支持第一种假设，Notch信号通路是星形胶质细胞中富集最显著的信号通路体内（表1一个)(补充表S22，载于m.tanvirauto.com作为补充材料)，我们发现Notch的靶基因仍然很高，有时会像星形胶质细胞一样增加体内成熟。我们的研究还表明Notch通路在培养的星形胶质细胞中没有被激活。虽然Notch1和Notch2配体都被表达在体外artroglia和体内在星形胶质细胞中，下游Notch效应因子Hes5未表达在体外，而Hes1的表达水平要低得多在体外．有趣的是，Notch配体delta-like 4 (Dll4)、Jagged 1 (Jag1)和Jag2在内皮细胞中高表达(R. Daneman和B. A. Barres，未发表数据)，它们普遍接触星形胶质细胞体内，提示成熟中枢神经系统中活跃的Notch信号可能是维持成熟星形胶质细胞命运所必需的。在培养的星形胶质细胞中存在高水平的免疫系统基因(如补体蛋白C3)，而在星形胶质细胞中没有体内，提供了一些证据，表明培养的星形胶质细胞更类似于反应性星形胶质细胞。未来使用类似方法纯化星形胶质细胞前体细胞和反应性星形胶质细胞的研究，以及我们在这里提供的数据库，应该能够更全面地描述培养的星形胶质细胞的性质。
讨论
CNS神经细胞类型转录谱数据库
在这项研究中,我们已经描述了新方法的开发高度净化敏锐地孤立的星形胶质细胞、神经元和OLs从发展到成熟(P1 P30)小鼠前脑和使用这些技术来产生一个转录组数据库的全基因组基因表达值主要在中枢神经系统的神经细胞类型。这个数据库为神经科学社区提供了一个资源，以更好地了解大脑的发展和功能。原则上，这些相同的方法现在也可以用于研究星形胶质细胞、神经元和OLs的基因表达在脑病理过程中的变化。
该细胞类型特异性基因表达数据库对现有的定性数据库(如ABA和GENSAT)进行了补充。将显示CNS细胞类型特异性的基因列表与ABA进行比较，显示出高度的一致性;然而，基因芯片阵列所覆盖的基因组使我们能够以更定量的方式识别更多的差异表达基因。此外，由于我们能够从各种出生后年龄的细胞中分离出细胞，我们的数据允许对基因表达的发育概况进行分析。这些数据，加上来自GENSAT的ABA和小鼠细胞系提供的区域表达信息，为神经科学家提供了强大的工具来分析时间、空间和细胞类型特异性的CNS基因表达。
新的细胞类型特异性标记物的鉴定
有必要改进中枢神经系统的神经细胞类型标记物。泛神经元、星形胶质细胞和OL标志物的鉴定长期以来一直存在问题，因为区域和亚型神经元的异质性很大。特别是目前星形胶质细胞的标记物不是在所有星形胶质细胞中均有表达，就是不能完全标记星形胶质细胞的胞体和所有突起。例如，GFAP是应用最广泛的星形胶质细胞标记物，它优先在白质星形胶质细胞中表达，而不是在灰质星形胶质细胞中表达，它不能标记所有的突起(布洪等人，2002)．同样，水通道蛋白4，虽然高度星形胶质细胞特异性，但也局限于星形胶质细胞末梢。Connexin 43只标记部分星形胶质细胞，内皮细胞也表达，S100β虽然同时标记灰质和白质星形胶质细胞，但它也标记OPCs和OLs。
在这里，我们发现Aldh1L1是一种非常有用的星形细胞特异性标志物。我们还发现，GENSAT Aldh1L1- egfp BAC小鼠具有星形胶质细胞的荧光标记，它忠实地遵循星形胶质细胞特异的Aldh1L1表达模式，因此为可视化发育和成年小鼠大脑中的星形胶质细胞提供了一个优越的工具。鉴于Aldh1L1似乎在几乎所有星形胶质细胞中表达，而不是其他CNS细胞类型，Aldh1L1启动子可能是一个有用的工具，以驱动星形胶质细胞中Cre的特异性表达。通过其特异性的表达模式，Pla2g7和Ascbg1也可能成为有用的星形细胞特异性标志物。
以类似的方式，我们的数据集允许识别许多适合神经元和OLs的标记。对于OLs，有许多髓鞘基因，如MBP，长期以来一直被用作有用的标记物，但由于这些基因高度定位于髓鞘，它们在涉及OL细胞体染色的定量研究中并不有用。我们已经鉴定了几个具有高度OL特异性的基因，包括Fa2h, Gpr62, Tmem125/6330530A05Rik，基因模型98和Plekhh1，这些基因有很大的潜力作为该谱系的改良标记。虽然已经鉴定出许多表达对神经元具有高度特异性的基因，但通过ISH分析或与ABA交叉参考，这些基因中绝大多数表现出区域特异性。Stathmin-like-2 (Scg10)是我们能够鉴定的最特异、表达最广泛的基因，这表明它适合作为泛神经元标记。
星形细胞转录组为星形细胞的发育和功能提供了许多新的线索
我们已经鉴定的星形细胞转录组为大脑中主要细胞类型之间代谢劳动分工的戏剧性本质提供了新的线索。糖原在星形胶质细胞中的优先储存和糖基化作用早已为人所知(2004赫兹,)．星形胶质细胞被认为在将谷氨酸分解为谷氨酰胺以及耦合突触活动和葡萄糖利用方面发挥着关键作用(Magistretti 2006)．我们的研究结果证实星形胶质细胞富集了这些代谢途径，如糖酵解和克雷布斯循环，但也揭示了星形胶质细胞富集的大量其他代谢途径(表1D)．例如，涉及氨基酸合成和降解的途径显著富集，例如甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸的合成途径优先存在。某些脂质合成途径在星形胶质细胞中也高度富集，例如，Acsbg1/泡泡糖/脂质苷优先表达，Acsbg1/泡泡糖/脂质苷是一种具有非常长链酰基辅酶a合成酶活性的蛋白质(frail等，2004年)．虽然星形胶质细胞长期以来被认为在谷氨酸降解中发挥主要作用，但我们的代谢途径分析表明，星形胶质细胞在谷氨酸生产的大多数或所有主要途径或谷氨酸的4碳主链上也高度富集，这表明星形胶质细胞的一个重要作用实际上可能是产生谷氨酸等神经递质，然后以谷氨酰胺等神经活性直接前体的形式将它们发送给神经元。然而，星形胶质细胞转录组不包括囊状谷氨酸转运蛋白或神经元中发现的突触蛋白(包括Vglut1、Vglut2、synapsin 1、synaptotagmin)的mrna，因此不支持星形胶质细胞调节谷氨酸分泌的观点体内．
我们所阐明的星形细胞转录组也指向许多关于星形细胞功能的假说。有争议的是，对细胞类型中表达最强烈的特定基因的了解应该为该细胞类型的可能功能提供重要线索。对于OLs来说，高表达的特异性基因主要是髓鞘基因，这与它们在髓鞘形成中最重要的作用一致。对于神经元而言，高表达的突触基因与其主要的神经传递作用相关。对于星形胶质细胞，对表达最多的特异性基因进行检测，可以发现分泌蛋白如ApoE、ApoJ/clusterin、Pla2g7、Sparc、hevin/Sparcl1和Mfge8，这些基因在星形胶质细胞中的功能我们知之甚少。其中一些星形细胞富集基因可能对星形细胞-突触或星形细胞-内皮细胞的相互作用很重要。在星形胶质细胞中，从P1到P7到P17，这些基因中有许多都显著上调，这表明它们编码的蛋白质在中枢神经系统发育过程中起着重要作用。这种可能性与星形胶质细胞调节突触形成能力的证据相一致(克里斯托弗森等人，2005年)．我们发现了许多与精神疾病有关的星形细胞丰富的基因，如精神分裂症和双相情感障碍，包括Npas3 (Pieper等人，2005年)， Mlc1[发现于远端星形细胞突起(布尔等人，2005年)], Lgi1/4 (顾等人，2004年；舒尔特等，2006)和Gpr56 (Mochida 2005)，为星形胶质细胞参与突触调节和神经和精神疾病的潜在途径提供了线索。
星形胶质细胞中富集了几种进化上保守的吞噬通路
在培养中，星形胶质细胞是高度吞噬细胞(罗丹等人，1997；Chang et al.， 2000)．虽然是哺乳动物星形胶质细胞吞噬的程度体内中枢神经系统胶质细胞在果蝇与哺乳动物星形胶质细胞相似的大脑已被证明介导凋亡细胞的清除并参与轴突修剪(Freeman等人，2003年；麦克唐纳等人，2006)．我们的研究确定了与果蝇胶质细胞相同的进化保守的吞噬通路秀丽隐杆线虫小鼠星形胶质细胞特异性高表达的细胞体内．这些包括Ced-1/Draper/Megf10(和Lrp1/CD91)、Ced-7、Ced-6/Gulp1和ced-2/Crk、ced-5/Dock1、ced-12/Elmo通路。此外，我们还鉴定了Mertk/Axl、αvβ5整合素通路，该通路此前被证实通过视网膜色素上皮细胞介导脱落棒外节段的吞噬作用(冯等人，2002；邓肯等人，2003；Finnemann和Nandrot, 2006年；Nandrot等人，2007年)，在星形胶质细胞中高度富集体内．这些通路的配体，ApoE和Mfge8，是星形胶质细胞基因中表达最高的，强调了它们对星形胶质细胞功能的可能重要性体内．目前还不清楚这些途径是协同作用还是独立介导依赖于受体特异性的特定类型的碎片清除。星形胶质细胞、OLs和神经元不表达Fc受体和Cd11/CD18b/整合素β2吞噬通路来介导抗体或补体调理碎片的清除，尽管这两个通路在小胶质细胞中高度表达。
星形细胞吞噬的潜在靶点是什么?在发育过程中，凋亡细胞必须被吞噬清除，一些证据表明哺乳动物星形胶质细胞体内可参与此过程(Krueger等，1995年)．在果蝇，研究表明，draper (Megf10)、Dock1和Rac1在生长差异引起的细胞死亡中是必需的，而促进死亡的相同邻近细胞受体也负责吞噬(李和贝克，2007年)．胶质细胞在吞噬作用中的功能体内在突触消除过程中，许旺细胞吞噬轴突尖端(轴突体)。毕晓普等人，2004)．同样，星形胶质细胞也被发现吞噬中枢神经突触(Steward和Messenheimer, 1978年)．Megf10和Mertk都在雪旺细胞中高度表达，因此是介导这一过程的极好候选基因，提示星形胶质细胞中这些吞噬通路的作用可能是帮助介导突触消除。我们已经确定的吞噬途径也是帮助介导淀粉样蛋白清除的极好候选途径。星形神经胶质在体外，在大脑切片上培养时，淀粉样蛋白沉积非常清晰(Wyss-coray等，2003年），Apoe和Mfeg8都有助于介导淀粉样蛋白清除（博德伯特等人，2007年)．累积起来，这些数据表明，我们已经确定的胶质吞噬细胞通路是参与轴突修剪、中枢神经系统和PNS突触消除、大脑内淀粉样蛋白清除的重要新候选通路，而这些通路的破坏可能导致阿尔茨海默病中淀粉样蛋白斑块的积累。
脚注
本研究得到了国家神经疾病研究所R01 NS045621 (B.A.B.)，国家眼科研究所R01 EY10257 (B.A.B.)，医学科学家培训计划基金MSTP GM07365 (j.d.c.， A.K.)，澳大利亚国家健康和医学研究委员会CJ Martin Fellowship 400438 (B.E.)，新加坡科学机构，技术与研究研究生奖学金(L.C.F.)、美国国家眼科研究所国家研究服务奖博士后奖学金(EY07033)、美国国立卫生研究院(nih)奖学金(DK54388)和CA095030 (S.A.K.)。我们特别感谢Lubert Stryer博士对Affymetrix基因图谱的建议、鼓励和支持，以及Barres实验室成员对这份手稿的讨论和批判性阅读。
- 信件应寄给约翰·d·卡霍伊，斯坦福大学神经生物学系，D205仙童大楼，299 Campus Drive, california, Stanford。jcahoy在}{stanford.edu
